前沿文献 | 培养法、mNGS、靶向定量PCR、靶向LAMP+CRISPR应用于检测感染性糖尿病足

引言

2021年10月，浙江大学医学院附属邵逸夫医院李霖主任、刘超主任联合陈欢博士团队在Frontiers in Microbiology杂志上发表了一篇关于快速检测糖尿病足感染（DFI）病原体的文章。糖尿病足感染是糖尿病最常见、最严重的并发症之一。其中，金黄色葡萄球菌（SA）是DFI最常见的病原菌之一，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的增多限制了抗生素的选择，使DFI治疗面临着巨大挑战。及时有效地控制病原菌感染是减少 DFI 患者截肢、致残致死的重要途径。目前，MRSA检测方法较多，主要包括表型检测（苯唑西林和头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂筛选法等）和MRSA耐药基因检测。微生物培养法是MRSA鉴定的金标准，但检测耗时长，无法在第一时间指导临床抗生素选择，不适当的抗菌疗法使严重感染的存活率降低5倍。

因此，本文采用了四种方法对感染性糖尿病足的感染菌进行鉴别。其中培养法和mNGS法为非靶向检测，而定量PCR和LAMP+CRISPR特异性针对MRSA进行检测。常规 PCR 和荧光定量 PCR 等比较成熟的技术需要精密的温度和光学控制系统，存在仪器价格昂贵又不够便携等缺点。mNGS是一种新型的检测方法，由于在时间、资金、仪器和技术专长方面成本高，目前还不能普及。CRISPR/Cas 系统因其独特的精准识别能力，在生物传感领域展现出广阔的应用前景。将等温扩增与 CRISPR/Cas联合，打破了传统分子诊断技术对设备的依赖性，在病原微生物现场快速检测中拥有巨大的应用潜力。

研究内容

1.LAMP+CRISPR方法建立

该研究将环介导等温扩增（LAMP）和CRISPR技术联合，通过简单、便携的扩增和荧光阅读器，实现快速、特异、灵敏地检测DFI患者样本中的MRSA，工作流程见图1。CRISPR-LAMP技术具有高度特异性，与其他9种葡萄球菌无交叉反应，最低可检测低至20拷贝的金黄色葡萄球菌特异性基因和耐药基因（见图2）。

图1 LAMP-CRISPR分析工作流程示意图

图2 LAMP-CRISPR的特异性（a）和最低检出限（b）

2.PMseq分析8个DFI样本

8个临床DFI样本进行了华大因源PMseq病原微生物高通量基因检测，mNGS的结果与金标准培养法的结果100%一致（见图4）。

图3 华大因源PMseq病原微生物高通量基因检测报告

图4 mNGS数据与培养方法的比较

3.四种方法的比较

本文使用LAMP-CRISPR、定量PCR和宏基因组测序（mNGS）对DFI临床样本进行检测，检测结果与金标准培养法进行比较。通过检测18个DFI临床样本对CRISPR-LAMP方法进行性能评估。对于非靶向的两种方法，mNGS和培养法的符合率为100%（本文以培养法为对照，所有入选的样本都有培养结果，没有验证培养为阴性的样本）。LAMP-CRISPR在速度和成本上都优于定量PCR，总体结果如图5。

图5 四种检测方法的比较

结论

①与其他诊断技术相比，对于特定病原体检测，LAMP-CRISPR能够在1小时内检测极低浓度的目标基因，比qRT-PCR更快，且不需要复杂的设备。

②该研究还选取了几个代表性样本进行mNGS分析。mNGS可以提供关于DFI微生物特征的全面信息，包括传统方法无法检测到的一些罕见病原体。mNGS还可以对样本中的微生物丰度进行相对定量，这对多微生物样本很有用。

③但是对于耐药基因的分析，目前无论是mNGS技术还是PCR技术的检测技术都存在明显的缺陷，即耐药基因和感染细菌不能做到关联检测。也就是说耐药基因不一定是来自感染的菌。

参考文献

Front. Microbiol., 07 October 2021

https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.742040

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